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油茶籽饼粕中甲醇提取物抑制黄曲霉菌效果及成(2)

来源:种子科技 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2020-10-08
作者:网站采编
关键词:
摘要:1.5 不同溶剂萃取相的抑菌效果 乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别称质量1 g溶解于10 mL无菌水,配成100 mg/mL的溶液,再依次稀释成50、33.5、25 mg/mL,用0.22 μ

1.5 不同溶剂萃取相的抑菌效果

乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别称质量1 g溶解于10 mL无菌水,配成100 mg/mL的溶液,再依次稀释成50、33.5、25 mg/mL,用0.22 μm醋酸纤维膜过滤[18]备用。

1.5.1 抑菌圈法

采用改良的牛津杯法[19]。用无菌吸管吸取100 μL黄曲霉孢子悬液(1.0×106 孢子/mL)到PDA平板表面,涂布均匀。取3个内径6 mm的牛津杯轻置于平板表面。每个杯体内加入200 μL不同浓度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相,静置15 min,用封口膜固定培养皿,于4 ℃放置12 h使提取液充分扩散,取出后置于29 ℃培养箱培养,48 h后测量抑菌圈直径,每处理重复3次,以无菌水作对照。

1.5.2 菌丝干质量法

吸取200 μL的1×106/mL孢子菌悬液,加入装有20 mL已灭菌的PDB培养基的三角瓶中,加入1%吐温80使黄曲霉孢子均匀分散,再分别添加200 μL不同浓度的乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相,使最终浓度分别为100、50、33.5、25 mg/mL,每个浓度梯度做3个重复,于29 ℃、180 r/min恒温摇床培养5 d后取出,用滤纸过滤,挑出菌丝于45 ℃烘箱内烘干至恒质量,称量、计算菌丝干质量。保留滤液,用于测定黄曲霉毒素[20]。

1.5.3 黄曲霉毒素含量测定

1.5.2所得滤液经酶联免疫亲和柱净化处理后测定黄曲霉毒素,测定方法参考GB (第一法)。液相色谱条件:Symmetry C18柱(150 mm×3.9 mm,5 μm)。流动相A:0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵, 流动相B:乙腈;柱温:35 ℃;流速:0.5 mL/min;进样量:10 μL;梯度洗脱:0 min,50%B;2 min 60% B;6~7 min,100% B;10~12 min,50% B。质谱条件:电喷雾离子源负离子模式(ESI+);毛细管压力:3.0 kV;离子源温度:100 ℃;脱溶剂气温度:450 ℃;脱溶剂气流量:650 L/h;锥孔气流量:50 L/h;扫描方式:多反应监测MRM。

1.6 正丁醇萃取相分离纯化和抑菌效果

采用柱色谱法。称取15 g正丁醇萃取物,加入50 mL蒸馏水,充分溶解后经AB-8大孔树脂柱层析,依次用2倍柱体积的乙醇水洗脱体系(蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇)洗脱,流速为20 mL/min,分别收集各部分洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥得到5种洗脱物。

分别称质量1 g上述5种洗脱物溶解于10 mL无菌水中,配成100 mg/mL的溶液,再依次用无菌水稀释成50和25 mg/mL,用0.22 μm醋酸纤维膜过滤[18]。采用抑菌圈法和菌丝干质量法,再测定黄曲霉毒素含量,具体方法同1.5.1、1.5.2和1.5.3。

1.7 活体上的验证试验

用75%乙醇对玉米和花生籽粒进行表面消毒,粉碎成较大颗粒,用无菌水调节含水量至20%以上,装入培养皿,接种1 mL黄曲霉孢子悬液(1.0×106 mL),再加入100 mg/mL75%乙醇洗脱物,混匀,以等量的无菌水作为对照,每隔24 h检测黄曲霉菌的生长情况,5 d后测定黄曲霉毒素含量。

1.8 75%乙醇洗脱物中的活性物质鉴定

将75%乙醇洗脱物用50%甲醇(体积比)溶解配制成浓度5 mg/mL,于10 000 r/min离心20 min,取上清液进飞行时间液质联用仪检测。液相条件:流动相A:0.1%(体积比)甲酸-水溶液,流动相B:0.1%(体积比)甲酸乙腈;流速0.8 mL/min;检测波长280 nm;色谱柱为ZORBAX-SBC18(100 mm×4.6 mm(i.d.),1.8 μm,安捷伦公司);进样量5 μL;柱温30 ℃。质谱条件:电喷雾离子源负离子模式(ESI-),扫描范围m/z 100~1 500;雾化气(GS1)50 psi;雾化气(GS2)50 psi;气帘气(CUR)35 psi;离子源温度550 ℃;离子源电压(IS):?4 500 V。检索谱库:Scifinder、Reaxy数据库。

1.9 数据分析

所有数据采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0统计软件进行数据处理和分析,用t检验法进行显著性检测,P<0.05,认为存在显著性差异。试验结果采用平均值±标准误的形式表示。

2 结果与分析

2.1 油茶籽粕不同溶剂萃取相的抑菌效果

2.1.1 对抑菌圈直径的影响

本研究采用80%甲醇、乙酸乙酯、正丁醇依次对油茶籽粕进行梯度萃取,每种溶剂的萃取得率有所不同(表1),乙酸乙酯相得率最低,仅2.44%,其次是水相,得率为16.61%,正丁醇的极性最大,其萃取得率最高,为30.25%。

表1 油茶籽粕不同溶剂萃取相的得率和抑菌效果(抑菌圈直径)Table 1 Diameter of inhibition zone of sequential extraction of different solvents at different concentrations萃取相Extract phase萃取得率Extractability /%抑菌圈直径Inhibition zone diameter/mmANOVA 25 (mg·mL-1)33.3 (mg·mL-1)50(mg·mL-1)100(mg·mL-1) 乙酸乙酯相Ethyl acetate phase2. 正丁醇相n-butanol phase30.<0.01 水相Aqueous phase16.

文章来源:《种子科技》 网址: http://www.zzkjzz.cn/qikandaodu/2020/1008/664.html



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