油茶籽饼粕中甲醇提取物抑制黄曲霉菌效果及成(9)

表5可见，所有样品均未检测出AFB2，添加不同浓度的水洗脱物和25%乙醇洗脱物的PDB培养液中均含有AFB1，且含量较高，可见，水洗脱物和25%洗脱物对AFB1的产生无明显的抑制作用；50%乙醇洗脱物在25 mg/mL浓度时AFB1含量与对照相比有所下降，但未能完全抑制产毒，当浓度升高时才能完全抑制产毒；75%乙醇洗脱物对黄曲霉产毒能力的抑制效果较明显，各浓度处理均未检出AFB1；100%乙醇洗脱物仅在高浓度（100 mg/mL）时能完全抑制AFB1的产生。

图2 正丁醇萃取相各洗脱物对黄曲霉菌菌丝干质量的影响Fig.2 Mycelial dry weight ofA. flavusby five eluents ofn-butanol extraction phase

表5 正丁醇萃取相各洗脱物中黄曲霉毒素含量Table 5 AFBs content in five eluents ofn-butanol extraction phase洗脱物Eluents浓度Concentration/(mg·mL-1)黄曲霉毒素质量分数AFBs content/(μg·kg-1) AFB1AFB2 水洗脱物Pure water 25%乙醇洗脱物25% alcohol 50%乙醇洗脱物50% alcohol 50NDND 100NDND 75%乙醇洗脱物75% alcohol eluent25NDND 50NDND 100NDND 100%乙醇100% 100NDND 对照

综上分析表明，油茶籽饼粕梯度萃取的正丁醇萃取相各洗脱物中，75%乙醇洗脱物能够显著抑制黄曲霉菌的生长，同时也能有效抑制黄曲霉毒素的产生。

2.2.4 活体验证试验

由活体验证试验可见，培养24 h时各处理及对照均有少量的黄曲霉菌生长，肉眼观察无明显区别，随后对照的黄曲霉菌生长明显加快，至48 h后玉米和花生表面均覆盖了一层白色菌丝，籽粒间开始出现黏连，而添加75%乙醇洗脱物后黄曲霉菌生长明显减缓，玉米和花生籽粒清晰可见（图3），此后处理与对照的区别更加明显，至72 h时对照样品上覆着一层较厚的菌丝膜，玉米和花生籽粒被菌丝黏连成块状，而75%乙醇洗脱物处理的样品籽粒仍为独立分开，仅在单个颗粒上出现少量菌丝。由此可见，75%乙醇洗脱物对黄曲霉菌生长有明显的抑制作用。5 d后对黄曲霉毒素进行测定，结果见表6，与对照相比，加入75%乙醇洗脱物后，玉米和花生中的AFB1含量呈现极显著的下降水平（P<0.01）。以上结果有力验证了75%乙醇洗脱物对黄曲霉菌生长和产毒的抑制作用。

图3 75%乙醇洗脱物对玉米、花生中黄曲霉菌生长的影响（48 h）Fig.3 Effect of 75% ethanol eluant on growth ofA. flavusin maize and peanuts (48 h)

表6 75%乙醇洗脱物对玉米、花生中黄曲霉产毒的影响（5 d）Table 6 Effect of 75% ethanol eluant on AFB1contents in maize and peanuts inoculated withA. flavus(5 d)处理Treatments黄曲霉毒素质量分数 AFB1 content/(μg·kg-1) 玉米 Maize花生 Peanut 对照Control0. 75%乙醇洗脱物75% ethanol eluantND0.

2.3 抑菌物质的结构鉴定

对75%乙醇洗脱物进行负离子模式分析，得到紫外色谱图（图4）。根据高分辨质谱结果拟合可能的分子式，通过Scifinder和Reaxy数据库检索结合二级质谱信息，推测化合物结构，分析鉴定出3种化合物。

化合物1：该化合物的出峰时间为9.822，[M-H]-为m/z755.204 8，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C33H40O20，根据二级质谱，化合物母核质荷比为285，结构中存在3个6碳糖结构，根据Scifinder和Reaxy数据库检索，推测该化合物为山奈酚-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖苷-(1→3)-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-O-β-D-吡喃半乳糖苷]（kaempferol-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranoside] ）。

化合物2：该化合物的出峰时间为10.61，[M-H]-为m/，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C32H38O19，根据二级质谱，化合物母核质荷比为285，结构中存在1个5碳糖结构，根据Scifinder和Reaxy数据库检索和推测该化合物为山奈酚-3-O-[2-O-β-D-吡喃木糖基-6-O-α-L-吡喃鼠李糖]-β-D-吡喃葡萄糖苷（kaemferol-3-O-[2-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside）。

化合物3：该化合物的出峰时间为15.26，[M-H]-为m/，根据高分辨质谱结果拟合的分子式为C42H46O22，根据二级质谱，化合物母核质荷比为285，比化合物1多一个多羟基香豆酸结构，根据Scifinder和Reaxy数据库检索和推测该化合物为山奈酚-3-O-(6-反式-对-香豆酰基）-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-O-β-D-吡喃半乳糖苷（kaempferol-3-O-[6-trans-p-coumaroyl)β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranoside]）。

图4 75%乙醇洗脱物紫外（320 nm）色谱图Fig.4 UV absorption chromatogram of 75% ethanol eluant (320nm)

表7 75%乙醇洗脱物中化合物的UPLC-Q-TOF/MS分析参数Table 7 UPLC-Q-TOF/MS parameters of target compounds in 75% ethanol eluant峰号Number保留时间Retention time/min[M-H]- 荷质比m/z分子式Formula化合物Compound分子结构Molecule structure 19..204 8C33H40O20kaempferol-3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranoside] 210..194 0C32H38O19kaemferol-3-O-[2-O-β-D-xylopyranosyl-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside 315..242 7C42H46O22kaempferol-3-O-[6-trans-p-coumaroyl)β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranoside]

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