油茶籽饼粕中甲醇提取物抑制黄曲霉菌效果及成

0 引 言

油茶（Camellia oleifera Abel.）是山茶科山茶属植物，是世界四大木本油料树种之一[1]。油茶籽油是中国独有的极具营养、健康及经济、社会价值的特色油脂资源，其不饱和脂肪酸含量高达90%以上，还含有蛋白质、多糖、皂苷、酚类、VE、甾醇、角鲨烯等多种功能性成分[2]，在各项主要指标上接近甚至超过橄榄油，能充分平衡人体营养，有利身体健康[3]。随着人们生活水平的提高和保健意识的不断增强，油茶籽油日益受到消费者的青睐，油茶籽的开发利用日益受到重视，随之而来的副产物的开发利用也逐渐被重视起来，但在质量控制方面仍存在不少问题，油茶籽在采收、贮存、加工及运输过程中存在着被有毒有害物质污染的风险，如苯并芘、黄曲霉毒素等[4]。

黄曲霉菌（Aspergillusflavus）是一种是常见的腐生真菌，易侵染花生、玉米和坚果等粮食经济作物，可以产生黄曲霉毒素（aflatoxins，简称AFs）[5]，低剂量的黄曲霉毒素对人及动物肝脏组织有破坏作用，会增加肝癌的发生率，高剂量的黄曲霉毒素可导致剧毒而致死[6]。黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ι类致癌物，可使人类和多种动物诱发原发性肝细胞癌，是目前已发现的最强的化学致癌物[7-9]。据联合国粮农组织（FAO）研究，世界范围内1/4的粮食作物受到真菌毒素的污染，且主要是受黄曲霉毒素的污染。它主要来自受污染的粮油及其制品如花生、花生油、玉米、大米、面粉、坚果、棉籽、牛奶等[10]。如何有效地防止黄曲霉污染已经成为一个亟待解决的重大问题。

长期以来人们对黄曲霉菌及毒素的研究还主要集中在检测技术的优化和毒素的脱除[11-13]。目前，植物和微生物源活性物质对黄曲霉和黄曲霉毒素的防治越来越受到人们的重视[14]。笔者前期研究表明，油茶籽不易感染黄曲霉菌，仅在高温、高湿环境或黄曲霉孢子大量存在条件下会被黄曲霉菌侵染，但其侵染和产毒量远远低于花生、玉米等易感染黄曲霉菌的油料，而且在人为接种黄曲霉菌后，随着培养时间延长，黄曲霉毒素含量呈下降趋势[15]。由此推断可能由于油茶籽中含有某些能够抑制黄曲霉菌生长和产毒的天然拮抗物质。但其中哪种物质对黄曲霉产生拮抗作用仍未见研究，对此，本研究开展了油茶籽饼粕不同溶剂萃取物对黄曲霉菌生长和产毒的抑制效果，筛选出抑菌物质类型，并进一步分离纯化鉴定出抑菌活性成分。以期为黄曲霉菌天然抗菌剂的研发提供参考和指导，同时也有利于拓宽油茶副产物的加工利用途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油茶籽：采自中国林业科学研究院亚热带林业研究所的油茶种植基地。成熟油茶籽采收后于60 ℃烘干至含水率约7%[16]，液压榨油后对茶饼进行干燥、粉碎，索氏抽提除去残余油脂，于4 ℃保存备用。

产毒黄曲霉菌种：购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心（CGMCC No. 3.06305）。

PDA培养基、PDB培养基购自杭州微生物试剂有限公司。其他测定用试剂均为分析纯，检测黄曲霉毒素和活性物质鉴定所用试剂均为色谱纯。AFs混合标样购自上海安谱公司。

1.2 仪器设备

6YY-190液压榨油机（河南省洛阳市汝阳液压机械厂），DKS-12水浴锅（嘉兴中新医疗仪器有限公司），B-811索氏抽提器（瑞士Buch公司），BSC-1000ⅡA2生物安全柜（苏州苏净安泰空气技术有限公司）；SHP-450生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；LDZF-30KB立式蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；DM-4B生物显微镜(德国Leica公司)；BS-1F全温度振荡培养摇床（常州金坛精达仪器制造有限公司）；Eppendorf mini Span离心机（德国Eppendorf公司）；液质联用色谱仪（美国Agilent科技公司）；UPLC-Triple-TOF/MS系统：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪（美国Waters公司），Triple TOF 5600+型飞行时间质谱（美国AB Sciex公司）。

1.3 黄曲霉孢子悬液的制备

用无菌吸管吸取0.4 mL无菌水，滴入干粉安瓿瓶内轻轻震荡，使黄曲霉菌粉末呈悬浮状态，吸取0.2 mL菌液移植于PDA斜面。于29 ℃培养箱培养48 h后，再转管一次，得到活化的黄曲霉菌种，培养5 d后，用含有0.1%吐温80的无菌水将孢子从PDA斜面洗下，采用梯度稀释法[17]，利用血球计数板在显微镜下计数，调整孢子悬浮液浓度为1.0×106 孢子/mL，菌悬液要现用现配。

1.4 油茶籽粕不同溶剂萃取物的制备

100 g脱脂的油茶籽粕加入1 000 mL 80%甲醇（体积比80:20），在60 ℃回流提取2 h，倾出提取液，再加入250 mL 80%甲醇，60 ℃提取1.5 h，将2次所得提取液合并，减压浓缩除去甲醇溶剂，水相部分依次用乙酸乙酯、饱和正丁醇进行梯度萃取，收集乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相，分别减压浓缩后于40 ℃真空干燥，于4 ℃冷藏备用。

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